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推荐MN的中抽或者大抽kit

时间:2019-10-02 15:46 来源:未知 作者:admin

  注:质粒需要高质量制备,推荐MN的中抽或者大抽kit。不去内毒素、或者国产公司的质量较差的中抽kit会极大影响病毒滴度。

  选中的部分就是LV transfer 质粒的主体,通常是位于两个LTR之间;

  然后两批混合起来,3000g离心10min去除细胞碎片,0.45 mM滤器除菌分装保存在-80待用。

  通常,第二代的包装系统能够兼容第三代的transfer 质粒,反之则不可以。

  Day 0:Set up 293T cells. 密度控制在转染的时候达到80%即可。太稀导致滴度上不去,太高后期细胞会死亡,导致滴度下降;细胞状态务必要足够好,传代时间在一个月之内。

  简而言之就是把transfer质粒跟包装系统质粒(2个或3个)按照一定的比例共转到HEK-293T中,合适的时间点收取病毒上清即可。

  通常LV包装系统分为1、2、3代,现在常用的是2代和3代。一般情况是代数越靠后越安全,但目前最流行的是第二代系统。

  48hr后通过XFP(如果有)荧光克隆阳性的细胞数计算病毒滴度(图3)。

  (一般实验不需要测滴度,直接感染目的细胞建系即可,比如六孔板每孔加入病毒2ml)。目的细胞铺到96-well plate/或者24-well plate,保证24hr后细胞覆盖20-40%之间。从1到8排依次5倍梯度稀释病毒后感染目的细胞(图2)(感染时间12hr)。

  Day1:对于100 mm dish按照如下比例配制转染细胞(其他dish按照底面积自行换算):

  如果只带有Puromycin等抗性基因,则需要用对应的药物筛选,然后通过克隆个数来计算病毒滴度(图4)。

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